Engineering E. coli to target bladder and colon tumor cells and characteriazation of the adhesion process.

Abstract

Las terapias actuales contra el cáncer poseen una eficacia limitada debido a la falta de especificidad, a su alta toxicidad y a su limitada capacidad de penetración en los tumores. La capacidad natural de las bacterias para colonizar y alcanzar áreas profundas del tumor las hace potenciales vehículos para la liberación de moléculas terapéuticas de manera eficiente. La biología sintética nos permite la modificación de las bacterias para mejorar la colonización de los tumores, aumentar la especificidad, reducir la toxicidad, y realizar una liberación precisa de moléculas terapéuticas en el interior del tumor. En esta tesis doctoral, la investigación ha sido dirigida a la modificación genética de la bacteria Escherichia coli (E. coli) utilizando biología sintética para conseguir una adhesión e invasión específica de las células tumorales, así como la liberación de una proteína "cargo" de interés en el citoplasma de la célula tumoral. Además hemos investigado la influencia de la motilidad bacteriana durante la adhesión específica a la célula tumoral. Primero, desarrollamos adhesinas sintéticas (SAs) que permiten la adhesión programada de E.coli a células tumorales que expresan el factor de crecimiento epidérmico (EGFR), un receptor tirosina-quinasa sobre-expresado en muchos tumores epiteliales humanos como por ejemplo los carcinomas de vejiga y colon. Las adhesinas sintéticas exponen en la superficie bacteriana un anticuerpo monodominio que se une específicamente a un antígeno expresado en la superficie de la célula tumoral (p.ej. EGFR). Hemos generamos SAs capaces de unir EGFR y se ha demostrado su correcta expresión en la superficie de E. coli tras su integración en el cromosoma bajo el control de un promotor constitutivo. Hemos demostrado que las bacterias modificadas mostraban una adhesión específica a células tumorales humanas de vejiga y colon que expresan EGFR. A continuación se generó la invasión específica de estas células tumorales insertando en el cromosoma de la cepa modificada con SAs, el gen que condifica a la proteína invasina (Inv) de Yersinia pseudotuberculosis bajo el control de un promotor inducible. Además, se testó la expresión de la invasina en combinación con la proteína formadora de poros Listeriolisina O (LLO) de Listeria monocytogenes para producir la liberación de una proteína "cargo" en el citoplasma de las células tumorales. Las adhesinas sintéticas contra EGFR también fueron expresadas en una cepa de E. coli productora de minicélulas, partículas bacterianas no vivas carentes de cromosoma, que pueden representar una alternativa interesante al uso de bacterias vivas frente a tumores. Hemos generado minicélulas expresando SAs que reconocen EGFR y una proteína "cargo" en el citoplasma. Sin embargo, en nivel de adhesión de estas minicélulas a las células tumorales que expresan EGFR fue muy bajo en comparación con las bacterias vivas expresando las mismas SAs. Este resultado nos condujo a estudiar las diferencias entre bacterias y minicélulas que podían explicar su distinto nivel de adhesión y descrubrimos la importancia de la motilidad bacteriana para una adhesión efectiva de E. coli a la célula tumoral diana. Los mutantes de E. coli sin flagelo, o que expresan un flagelo no motil, no se unían a las células tumorales a pesar de expresar las SAs. Esta baja adhesión de las bacterias no motiles no se podía compensar mediante el movimiento de las bacterias en un flujo unidireccional o por centrifugación para forzar el contacto con la célula. Descubrimos que tras un contacto inicial, E. coli debe establecer simultáneamente varios puntos de adhesión con la superficie de la célula diana para crear una adhesión permanente. La rotación flagelar en una sola dirección, a favor de las agujas del reloj o en contra de las agujas del reloj, es suficiente para generar estos movimientos locales y para establecer la adhesión permanente de la bacteria, que se caracteriza por la ausencia de movimiento de la bacteria. También observamos que ni la ruta para sensar superficies mediada por la lipoproteína NlpE, ni la proteína “freno” YcgR, que une el dinucleotido cíclico de guanosina difosfato (cyclic-di-GMP), son requeridas para la adhesión permanente de la bacteria a las células tumorales. Finalmente, hemos extendido nuestras conclusiones obtenidas con E. coli expresando SAs pueden aplicarse a la adhesión de bacterias patógenas a las células del huésped mamífero. Hemos demostrado que el flagelo es necesario para la adhesión mediada por adhesinas naturales presentes en E. coli uropatógenas y en Salmonella enterica sv. typhimurium