Protective role of mitochondrial uncoupling protein UCP3 and the transcription factor Nrf2 against cardiac ischemia-reperfusion injury and their involvement in ischemic preconditioning

Abstract

Mitochondria are a main source of reactive oxygen species (ROS) in cells, particularly in pathological conditions such as ischemia-reperfusion (IR). Mitochondrial uncoupling proteins UCP2 and UCP3 play an important role in the control of ROS production by the electron transport chain. Besides, the transcription factor Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2) is a master regulator of the cellular redox homeostasis. In this thesis, we aimed at analysing the regulation of UCP3 and Nrf2 in response to hypoxia and their protective effect against cardiac IR injury. We have found that hypoxia induces UCP3 expression and Nrf2 nuclear accumulation in C2C12 myotubes and HL-1 cardiomyocytes. These effects are mediated by the activation of p38 MAPK that in turn phosphorylates and activates ATF-1. Moreover, hypoxia/reoxygenation increases mitochondrial superoxide production and induces UCP3 expression and Nrf2 nuclear accumulation to a greater extent than hypoxia alone. Likewise, simulated ischemia and simulated ischemia-reperfusion (SIR) increase UCP3 expression and the activation of both Nrf2 and ATF-1 in HL-1 cells. Consistent with enhanced superoxide production after hypoxia/reoxygenation, SIR augments HNE-protein adducts, indicating increased oxidative stress. Nrf2 activation and ATF-1 phosphorylation also increase in isolated perfused hearts subjected to IR or ischemic preconditioning (IPC), from both UCP3-KO and wild-type mice, although this increase is higher in hearts lacking UCP3. Similarly, active caspase-3 expression is enhanced in these conditions, particularly in UCP3-KO hearts, which reflects increased damage. UCP3 plays a cardioprotective role against IR injury, since isolated perfused hearts from mice lacking this protein present larger infarct size than those from wild-type mice. Consistent with this result, creatine kinase activity in the coronary effluent is higher in UCP3-KO than in wild-type mice at reperfusion. The cardioprotective effect of UCP3 against IR injury is even more relevant in aged than in adult mice and is also evident after left anterior descending (LAD) coronary artery ligation followed by reperfusion, as the histological analysis showed that UCP3 knockout hearts present larger infarct size than wild-type hearts. Moreover, UCP3-KO mice have a tendency to exhibit increased signs of cardiac damage as evaluated by echocardiography. A metabolomics analysis showed that, in ischemic conditions, UCP3 affects on the accumulation of the Krebs cycle intermediates. These data suggest that lipid and energy metabolism are the pathways more likely to be modulated by UCP3. The transcription factor Nrf2 plays a cardioprotective role against IR injury, since isolated perfused hearts from mice lacking Nrf2 present larger infarct size than those from wild-type mice. Accordingly, creatine kinase activity in the coronary effluent is higher in Nrf2-KO than in wildtype mice at reperfusion. Our results indicate that Nrf2 is involved in IPC, since the absence of this factor abolishes IPC protective effects.

Las mitocondrias son una fuente principal de especies reactivas de oxígeno (ROS) en las células, particularmente en condiciones patológicas como la isquemia-reperfusión (IR). Las proteínas desacoplantes mitocondriales UCP2 y UCP3 juegan un papel importante en el control de la producción de ROS por la cadena de transporte de electrones. Además, el factor de transcripción Nrf2 (nuclear factor-erythroid 2-related factor 2) es un regulador maestro de la homeostasis redox celular. En esta tesis, nos planteamos analizar la regulación de UCP3 y Nrf2 en respuesta a la hipoxia y su efecto protector frente al daño cardiaco por IR. Hemos encontrado que la hipoxia induce la expresión de UCP3 y la acumulación nuclear de Nrf2 en los miotubos C2C12 y los cardiomiocitos HL-1. Estos efectos están mediados por la activación de p38 MAPK, que a su vez fosforila y activa a ATF-1. Además, la hipoxia/reoxigenación aumenta la producción de superóxido mitocondrial e induce la expresión de UCP3 y la acumulación nuclear de Nrf2 en mayor medida que la hipoxia sola. Asimismo, la isquemia simulada y la isquemia-reperfusión simulada (SIR) aumentan la expresión de UCP3 y la activación de Nrf2 y ATF-1 en las células HL-1. De acuerdo con la producción incrementada de superóxido tras la hipoxia/reoxigenación, la SIR también aumenta los aductos HNE-proteína, lo que indica un aumento del estrés oxidativo. La activación de Nrf2 y la fosforilación de ATF-1 también aumentan en los corazones aislados perfundidos y sometidos a IR o precondicionamiento isquémico (IPC), tanto de ratones UCP3-KO como de ratones de tipo silvestre, aunque este aumento es mayor en los corazones que carecen de UCP3. De forma similar, la expresión de la caspasa-3 activa aumenta en estas condiciones, particularmente en los corazones UCP3-KO, lo que refleja el daño aumentado en los mismos. UCP3 juega un papel cardioprotector frente al daño por IR, ya que los corazones aislados perfundidos de ratones que carecen de UCP3 presentan un tamaño de infarto mayor que los ratones de tipo silvestre. De acuerdo con este resultado, la actividad creatina quinasa en el efluente coronario es mayor en los ratones UCP3-KO que en los de tipo silvestre. El efecto cardioprotector de UCP3 frente al daño por IR es aún más relevante en ratones viejos que en adultos y también es evidente después de la ligadura de la arteria coronaria descendente anterior izquierda (LAD) seguida de reperfusión, ya que el análisis histológico mostró que los corazones que carecen de UCP3 presentan un tamaño de infarto mayor que los corazones de tipo silvestre. Además, los ratones UCP3-KO tienden a mostrar signos aumentados de daño cardiaco, según lo evaluado por la ecocardiografía. El análisis metabolómico mostró que, en condiciones de isquemia, UCP3 afecta a la acumulación de intermediarios del ciclo de Krebs. Los datos sugieren que el metabolismo de lípidos y el energético son las vías con mayor probabilidad de ser moduladas por UCP3. El factor de transcripción Nrf2 juega un papel cardioprotector frente al daño por IR, ya que los corazones aislados perfundidos de ratones que carecen de Nrf2 presentan un tamaño de infarto mayor que los de tipo silvestre. Asimismo, la actividad creatina quinasa en el efluente coronario es mayor en ratones Nrf2-KO que en ratones de tipo silvestre durante la reperfusión. Nuestros resultados indican que Nrf2 está implicado en el IPC, ya que la ausencia de este factor elimina los efectos protectores del IPC