Papel de los Telomeric repeat-containing RNA (TERRA) en la biología del telómero y en pluripotencia mediado por la proteína telomérica TRF1

Abstract

Debido al estado altamente heterocromatinizado del telómero se pensaba que el final de los cromosomas no era transcrito. Sin embargo, hace una década se demostró que los telómeros se transcriben en una familia de lncRNAs denominados Telomeric repeat-containing RNA o TERRA. En los últimos años, un gran número de funciones diferentes han sido asociadas a estos transcritos. Sin embargo, la falta de modelos genéticos KO para TERRA ha impedido confirmar estas funciones en sistemas celulares. La falta de modelos se debe mayoritariamente a que su origen subtelomérico no está claro. En humanos, los estudios más recientes han propuesto que TERRA se podría transcribir de 18 loci diferentes, dificultando en gran medida la generación de células KO para TERRA. Uno de los principales objetivos de mi tesis, ha sido identificar los posibles loci de TERRA humanos, con el objetivo de generar células humanas KO para TERRA. Primero evaluamos los 18 loci previamente descritos, encontrando que el 80% de estos loci estaban estructuralmente conservados. Sin embargo, los transcritos de estos subtelómeros estructuralmente conservados no mostraban características típicas de TERRA. Sin embargo, sí encontramos características propias de TERRA en los transcritos del subtelómero 20q. Esto nos permitió generar células humanas tumorales ALT 20q-TERRA KO. Estas células presentaban una drástica disminución de los TERRA totales y nos permitieron probar que TERRA es esencial para mantener la integridad y la longitud telomérica. En una siguiente aproximación, usando de nuevo el modelo de células 20q-TERRA KO, caracterizamos el papel de TERRA en la formación de la heterocromatina telomérica. Así, demostramos que TERRA es esencial para el depósito de marcas de heterocromática, incluyendo a H3K27me3 (una marca que no se había descrito previamente en el telómero) y HP1 a los telómeros. El papel de TERRA en el mantenimiento de la heterocromatina telomérica estaba mediado por su interacción con el complejo PRC2 y el reclutamiento del mismo a los telómeros. Por otra parta, hemos caracterizado el mecanismo por el cual la proteína telomérica TRF1 es importante para el mantenimiento de la pluripotencia y el papel de TERRA en este proceso. TRF1 es esencial para la protección telomérica, previniendo que los telómeros se fusionen y degraden, además diferentes evidencias experimentales apuntan a que TRF1 tiene también un papel importante en el mantenimiento de la pluripotencia. Encontramos que el silenciamiento de TRF1 en iPSCs (células madre pluripotentes inducidas) murinas causa un gran cambio en la expresión génica, fundamentalmente de genes asociados a pluripotencia y diferenciación celular. Estos cambios estaban asociados a un dramático incremento de la unión de PRC2 al DNA y de la deposición de la marca del sintetizada por este complejo, la H3K27me3. Hemos demostrado que el silenciamiento de TRF1 incrementa los niveles de TERRA y que TERRA se une a los promotores de los genes cuya expresión cambia tras eliminar TRF1. Estos resultados son consistentes con un modelo en el que los cambios de expresión de TERRA dependiente de TRF1 modulan el reclutamiento de PRC2 (Polycomb Repressive Complex 2) y la expresión de genes asociados a pluripotencia y diferenciación.

Due to the highly heterochromatic status of the telomere, it was thought that the telomere not transcribed. However, a decade ago, our lab found telomere transcription. Telomere transcription gives rise to a family of lncRNAs called Telomeric repeat-containing RNA or TERRA. Over the last few years, a plethora of different functions have been assigned to TERRA, but the in vivo role of TERRA remain unknown. This is due to the lack of TERRA KO genetic as a result of the lack of information about the TERRA locus. In human, a study has proposed that TERRA could be transcribed from 18 different loci. That large amounts of loci still avoiding the generation of cells lacking TERRA. However, in mice, it has been described that TERRA are generated mostly from some subtelomeres. Based on this, the main aim of my thesis was to identify the human TERRA loci in order to generate human cells lacking TERRA. To this end, we evaluated the 18 different loci previously proposed to be TERRA origins. We found that 80% of the loci were in structurally conserved subtelomeres. We could not find TERRA features for the transcripts arising from these structurally conserved subtelomeres. Interestingly, we found TERRA features in the transcripts from the subtelomere 20q. Next, generated human ALT cancer cells knock-out for the 20q-TERRA locus by using the CRISPR-Cas9 system. These cells presented a drastic downregulation of total TERRA. The 20q-TERRA KO cells allowed us to characterize the TERRA role in telomere biology and we found that TERRA is essential to maintain telomere integrity and telomere length. Then, we characterized the role of TERRA in telomere heterochromatin formation. We proved that TERRA is essential for the deposition of heterochromatic histone marks including H3K27me3, a mark that is not normally associated with the telomere, and HP1 to the telomeres. We found that the role of TERRA in telomeric heterochromatin maintenance could be mediated through their interaction with the Polycomb repressive complex 2 (PRC2) and its recruitment to the telomeres. Next, we characterized the mechanism of the telomeric protein TRF1 in pluripotency maintenance and the implication of TERRA in this phenomenon. TRF1 is essential for telomere protection, preventing telomeres from degradation and fusion. There are evidences suggesting that TRF1 could have a role in the maintenance of pluripotency and embryonic development. We found that TRF1 depletion in murine iPSCs (induced pluripotent stem cells) cause drastic changes in gene expression, mostly in genes related with pluripotency maintenance and cell differentiation. Also we found that these trascriptional changes were accompanied by vast epigenetics changes. The changes found include an increase in PRC2 binding to the DNA, and H3K27me3 deposition. We found that TRF1 depletion increases TERRA transcription and that TERRA binds to genes which expression changes after TRF1 depletion. These results are consistent with a model in which TRF1-dependent changes in TERRA levels modulate polycomb recruitment to pluripotency and differentiation genes.