Identification of senescense-associated IL6 as a key component for cellular reprogramming

Abstract

Uno de los mayores retos de la biología celular es entender cómo manipular la identidad de las células. Un ejemplo de plasticidad celular consiste en la expresión in vitro de cuatro factores de transcripción (Oct4, Sox2, Klf4 y cMyc (OSKM)), que convierte cualquier célula diferenciada en células pluripotentes inducidas en un proceso conocido como reprogramación celular. Nuestro grupo ha demostrado con anterioridad que este proceso también ocurre in vivo en ratones que contienen un transgén inducible para los mismos cuatro factores (i4F). Creemos que los mecanismos implicados en este proceso nos ayudarían a manipular la identidad de las células y podrían aplicarse en la regeneración de tejidos. Las células senescentes son producidas en respuesta a múltiples daños y se caracterizan por una permanente parada del ciclo celular y por la abundante secreción de factores que forman el fenotipo secretor asociado a la senescencia (SASP). Estos factores secretados afectan al desarrollo tumoral, a la regeneración y a las respuestas inmunitarias. Primero, estudiamos cuál sería su efecto en la reprogramación in vitro para encontrar nuevos factores que favorezcan el proceso. Sorprendentemente, el medio condicionado (CM) senescente favorece la reprogramación y su efecto no se debe únicamente a un aumento de la proliferación. Analizando cómo los supresores tumorales Ink4a/Arf y p53 podrían regular el SASP, observamos que el efecto beneficioso en la adquisición de pluripotencia aumentaba en las células deficientes para p53 y se bloqueaba en ausencia de Ink4a/Arf. Además, observamos que solo Ink4a es necesario para la expresión de los factores del SASP. Más adelante identificamos la citoquina IL6 como el factor determinante para favorecer la reprogramación. Se analizó también el efecto de TNF pero, se observó que inhibía la reprogramación. Cuando IL6 era neutralizada en el CM o directamente en el cultivo reprogramable, el proceso se bloqueaba completamente. Esto sugiere que IL6 podría ser secretada por células dañadas que expresan OSKM o que en ausencia de IL6, la actividad inhibitoria de TNF tendría un papel mayor. Además, las células senescentes también favorecen la reprogramación in vivo a través de la secreción de IL6. Por otra parte, se confirmó que IL6 es crucial usando un modelo deficiente para IL6R en el que la señalización inducida por la citoquina está bloqueada. En base a los resultados obtenidos sobre la cinética de reprogramación, concluimos que el eje IL6-IL6R es importante en las primeras etapas de la transición y después, es reemplazado por el eje LIF-LIFR, que coincide con la activación y mantenimiento de la pluripotencia. Marcadores de pluripotencia, como Nanog o los genes endógenos Oct4 y Sox2, así como el marcador de membrana SSEA1, no se inducen en células deficientes para IL6R. Además, estas células no son capaces de expresar Lifr en las etapas tardías y la sobre-expresión de Lifr hace que la adquisición de pluripotencia sea independiente de IL6. Por lo tanto, pensamos que durante la reprogramación celular hay dos fases: la primera que es dependiente del eje IL6-IL6R e induce la expresión de Lifr y éste inicia la segunda fase dependiente del eje LIF-LIFR. Parte de estos resultados se han observado también in vivo y refuerzan la idea de que IL6 tiene un papel esencial en la reprogramación celular. Entender el mecanismo ayudará a desarrollar estrategias para inducir plasticidad in vivo que podrían aplicarse en procesos de regeneración

A major challenge of current cell biology is to understand how to change the identity of cells. A paradigmatic example of cell plasticity consists on the in vitro overexpression of four transcription factors (Oct4, Sox2, Klf4 and cMyc (OSKM)) that can convert essentially any differentiated cell into an embryonic pluripotent cell in a process known as cellular reprogramming. Our group has previously demonstrated that this process can also occur in murine tissues in vivo using an inducible transgene expressing the same four factors (i4F). This demonstrates that reprogramming is possible in an adult organism. We hypothesize that the mechanism involved in this process may provide clues to understand and manipulate tissue repair and regeneration. Senescent cells are produced in response to multiple types of damage and are characterized by a permanent cell cycle arrest and a robust secretion of factors, which are part of the senescence-associated secretory phenotype or SASP. These SASP factors have complex effects on tumor development, tissue repair or immune responses. We tested their effect on in vitro reprogramming to find new pro-reprogramming factors. Interestingly, conditioned medium (CM) from senescent cells favours reprogramming and its effect cannot be explained only by an increase in proliferation. Analyzing how the tumor suppressors Ink4a/Arf and p53 modulate the SASP, we observed that the beneficial effect on the acquisition of pluripotency was exacerbated when p53 was not present and impaired in the absence of Ink4a/Arf. Indeed, only Ink4a is necessary for the expression of SASP factors. We have identified IL6 as the key paracrine pro-reprogramming factor contained in the CM. TNF was also studied however; it seems to have a detrimental effect on reprogramming. When IL6 was neutralized in the CM or directly in the reprogramming culture, the process was completely blocked. This suggests that IL6 could be secreted by damaged cells overexpressing OSKM or that, TNF inhibitory activity could affect reprogramming negatively in the absence of IL6. Importantly, senescent cells also promote in vivo reprogramming through the secretion of IL6. We confirmed the concept that IL6 is crucial during reprogramming using a model deficient for IL6R where IL6 signaling is completely absent. From kinetic experiments, we concluded that the IL6-IL6R axis is important at the early phases of reprogramming and then, it is replaced by the LIF-LIFR axis that coincides with the activation and maintenance of pluripotency. Accordingly, pluripotency markers, such as Nanog or endogenous Oct4 and Sox2, as well as surface marker, SSEA1, are not induced in IL6R null i4F MEFs. Interestingly, IL6R deficient MEFs failed to upregulate Lifr in the late phases of reprogramming and the overexpression of Lifr rendered reprogramming independent of IL6. Therefore, we hypothesize that during reprogramming there are two phases: the first one depends on IL6-IL6R axis that induces Lifr which starts the second phase, which is dependent on LIF-LIFR axis. Part of these results has been addressed also in vivo, reinforcing the idea that IL6 plays an important role of reprogramming. Understanding the mechanism behind will provide clues for inducing plasticity in vivo that could have applications in regeneration processes