Identificación molecular de enfermedades OXPHOS: aproximaciones diagnósticas y bioinformáticas mediante secuenciación masiva

Abstract

Las enfermedades del sistema de fosforilación oxidativa mitocondrial (EM‐OXPHOS) se pueden originar por mutaciones en genes codificados en dos genomas: el DNA mitocondrial (mtDNA) o el DNA nuclear (nDNA). Esto obliga a establecer estrategias de análisis que tengan en consideración las particularidades propias de cada genoma. Por lo general, estas enfermedades cursan con afectación multisistémica y presentan una amplia variabilidad clínica. Identificar la causa genética resulta fundamental para: a) evitar el peregrinaje de los pacientes entre distintos especialistas y los diferentes niveles del sistema sanitario, con el consiguiente retraso en el diagnóstico de certeza; b) clasificar adecuadamente la EM‐OXPHOS concreta, debido a que cada vez se conocen más cuadros clínicos con afectación de diferentes órganos y tejidos asociados a diferentes genes y mutaciones; y c) contribuir a identificar los posibles tratamientos aplicables específicamente a pacientes con una determinada causa genética. El objetivo de esta tesis doctoral es el desarrollo, mejora y aplicación de metódicas genético‐moleculares y bioinformáticas con el propósito de su traslación al ámbito del diagnóstico genético de las EM‐OXPHOS. Se han desarrollado y adaptado estrategias de análisis molecular para analizar el mtDNA en profundidad y detectar desde variaciones simples de un nucleótido hasta grandes deleciones, empleándose tanto métodos genéticos tradicionales, como aproximaciones de secuenciación masiva. En este último caso se ha desarrollado un pipeline completo de análisis de mtDNA a partir de datos de la plataforma PGM (Life Technologies). El estudio del genoma nuclear fue abordado inicialmente con paneles de genes, mediante la integración y optimización en scripts propios de un sistema de filtrado de variantes frecuentes, un informe de cobertura apropiado (que indica cobertura mínima en las regiones de interés) y el programa de anotación Annovar. Posteriormente, se realizó una aproximación mediante secuenciación del Exoma (WES) con la oportuna adaptación del citado sistema de anotación, la inclusión del análisis de mtDNA residual y, finalmente, la detección de variaciones en el número de copias (CNVs). El enfoque fundamentalmente traslacional de la investigación desarrollada tuvo en cuenta el balance coste/beneficio y su potencial viabilidad dentro del Sistema Sanitario. En total, y gracias a las estrategias de análisis empleadas, en el periodo de tiempo estudiado (5 años) se ha logrado el diagnóstico genético de 147 pacientes y se han encontrado 52 variantes distintas con significado incierto. Finalmente, se propone un diagrama de flujo que aborda el diagnóstico de estas patologías mediante la integración de las diferentes metodologías y tipos de muestras empleadas en la actualidad con el objetivo de orientar el diagnóstico hacia un uso racional de los recursos de acuerdo con la información fenotípica inicial

Mitochondrial disorders due to defects of oxidative phosphorylation system (OXPHOS disorders) are a group of rare diseases that can be produced by mutations in genes encoded by two genomes: mitochondrial DNA (mtDNA) or nuclear DNA (nDNA). This fact makes necessary to establish analysis strategies which take into account the specific characteristics of each genome. Most of these diseases show multisystemic phenotypes with a wide clinical variability. Reaching an accurate genetic characterization is crucial: i) to avoid the diagnostic odyssey and consequently the delay in diagnosis, ii) to classify properly the mitochondrial disorder, as there are more and more clinical pictures with involvement of different organs and tissues that are associated with distinct genes and mutations, and iii) to contribute to identify possible treatments which can be particularly tailored for patients with a specific genetic cause. The purpose of this doctoral thesis is the development, improvement, and application of molecular genetic methods and bioinformatics approaches with the aim of being transferred to the area of clinical genetic diagnosis of OXPHOS disorders. In this work, strategies of molecular analysis were developed and adapted to analyze mtDNA in depth and to detect from single nucleotide variations to large deletions. During the process, traditional methods and massively parallel sequencing (MPS) technologies were applied. A complete pipeline for mtDNA analysis by MPS was developed using data from the PGM platform (Life Technologies). The study of the nuclear genome was approached initially by gene panels, through the integration and optimization of own scripts to establish a system for filtering frequent variants, to generate an appropriate coverage report (that indicates minimum coverage in the regions of interest), and the Annovar annotation system. Then, exome sequencing (WES) studies were carried out with the adaptation of the previously developed annotation system, including the analysis of residual mtDNA and a pipeline for the detection of copy number variants (CNVs). This work presents a translational focus, bearing in mind the cost‐benefit analysis and its viability within a Health System. Thus, the application of the developed tools for analysis, in the period of time studied (5 years), led to the genetic characterization of 147 patients, and 52 different variants of uncertain significance. In conclusion, a diagnostic flow chart for OXPHOS disorders is proposed based on initial phenotypic information and the integration of different methodologies and types of biological samples, with the aim of guiding the diagnosis under a rational use of resources