Discovery of a novel antitermination system present on many conjugative plasmids of Gram-positive bacteria

Abstract

In this thesis, I show that proper expression of the conjugation genes requires the presence of a processive antitermination system that is located near the beginning of the conjugation operon of plasmid pLS20. This system antiterminates several intrinsic terminators located inside the conjugation operon. I developed an in vivo terminator screening system that is based on expression of the reporter gene gfp to characterize this novel antitermination system, which we named conAn (conjugation Antitermination). The processive antiterminator systems described so far are based on one component, being either a protein or RNA moiety. The conAn system of pLS20 is a bipartite antitermination system that is composed of a protein and an RNA component. The RNA component is responsible for antitermination and the protein component is required for processive antitermination. The first gene of the conjugation operon, gene 28 (renamed conAn1), encodes the processivity factor, and its downstream region codes for the antiterminating RNA moiety, named conAn2. Mutation and deletion analyses were used to characterize ConAn1 and conAn2. Additional experiments have resulted in three other scientific progresses. First, I have demonstrated that the conAn system allows for differential expression of genes within the conjugation operon. Second, I have shown that bipartite conAn-like antitermination systems are also present on at least eight other conjugative plasmids of different G+ bacteria. These other conAn-like systems share only limited similarity between them and with the conAn system of pLS20. Notwithstanding, in silico analyses allowed us to identify more than 600 putative conAn systems present on likely conjugative elements present in G+ bacteria. Thus, these studies have multiplied the number of P-AT that we know today. Finally, it seemed logic that the end of the conjugation operon should be followed by a specific termination signal that is resistant to the conAn antitermination system to prevent undesired transcription of downstream regions. Remarkably, as far as we know, special termination signals that are resistant to antitermination systems have not been described in the literature. I discovered that pLS20 contains an intrinsic terminator that is resistant to conAn-mediated antitermination. This special terminator is located downstream of pLS20cat gene 64. Mutational analysis showed that terminator strength and especially the length of the stem are important for its antitermination-resistant phenotype. The results obtained during the studies of this thesis lead to a better insight in the regulatory repertoire of transcriptional regulation in general and to that of conjugative plasmids in G+ bacteria in particular. I provide evidence that proper expression of conjugation genes of systems containing a conAn system depends on the compatibility of the conAn components with the transcription machinery of the host. This implies that the conAn system affects the dissemination potential of a conjugative plasmid, and hence this may have important impacts on the spread of AR gen

En esta tesis, se muestra que la correcta expresión de los genes de conjugación en el plásmido pLS20 requiere de la presencia de un sistema de aniterminación “procesivo” (processive antitermination, P-AT) al inicio del operón de conjugación. Mediante un sistema de expresión in vivo del gen reportero gfp, desarrollado en nuestro laboratorio, se ha comprobado que este antiterminador es capaz de eliminar varios terminadores transcripcionales ubicados dentro del operón, por lo que lo hemos denominado sistema conAn (conjugation Antitermination). Los sistemas P-AT descritos hasta ahora se basan en un componente, ya sea una proteína o un fragmento de RNA. El sistema conAn de pLS20 es un sistema de dos componentes, proteína-RNA. El RNA es responsable de la antiterminación y la proteína es necesaria para que la antiterminación sea “procesiva”. El primer gen del operón de conjugación, el gen 28 (renombrado conAn1), codifica el factor de procesividad y su región aguas abajo codifica el RNA responsable de la antiterminación, denominado conAn2. Tras la caracterización del sistema conAn, experimentos adicionales han dado como resultado otros tres avances científicos. Primero, demostramos que el sistema conAn permite la expresión diferencial de genes dentro del operón de conjugación. Segundo, identificamos que el sistema de dos componentes conAn también está presente en al menos otros ocho plásmidos conjugativos de diferentes bacterias G+. Estos otros sistemas conAn tienen una baja similitud entre ellos y respecto as sitema conAn de pLS20. A pesar de ello, se han identificado más de 600 posibles homólogos mediante análisis in silico. En tercer lugar, en esta tesis se describe la presencia de un terminador intrínseco que es resistente a la antiterminación mediada por conAn. Este terminador especial está ubicado aguas abajo del gen 64 pLS20cat. Sorprendentemente, hasta donde sabemos, las señales de terminación especiales que son resistentes a los sistemas de antiterminación no se han descrito en la literatura. Mutaciones en este terminador han demostrado que la fuerza del terminador y especialmente la longitud del “stem” son importantes para la resistencia a la antiterminación. Los resultados obtenidos durante los estudios de esta tesis conducen a una mejor comprensión de la regulación transcripcional en general y de los plásmidos conjugativos en bacterias G + en particular. Estos estudios proporcionan la evidencia de que la expresión adecuada de genes de conjugación depende de la compatibilidad de los componentes conAn con la maquinaria de transcripción del huésped. Esto implica que el sistema conAn afecta al potencial de diseminación de plásmidos conjugativos y, por lo tanto, esto puede tener un impacto importante en la propagación de los genes de resistencia a antibióticos