Deficiencias de complejos oxphos: identificación y caracterización funcional de nuevas mutaciones nucleares

Abstract

Las enfermedades mitocondriales (EM), son un grupo heterogéneo de trastornos genéticos caracterizados mayoritariamente por un defecto en la cadena respiratoria mitocondrial (CRM) o sistema OXPHOS que pueden tener origen en mutaciones tanto en el ADN mitocondrial como en genes localizados en el ADN nuclear. Las EM presentan una gran variabilidad clínica, son mayoritariamente multisistémicas, y genéticamente muy diversas (más de 300 genes asociados a EM en la actualidad). Por ello, varias guías y recomendaciones de expertos en EM proponen la utilización de métodos de secuenciación masiva (NGS) como primera aproximación al diagnóstico genético con el objeto de estudiar de forma amplia los genes asociados a EM antes de plantear otras pruebas diagnósticas más invasivas. La primera parte de esta tesis, se ha centrado en la caracterización genético-molecular de una cohorte de 166 pacientes de edad pediátrica con sospecha clínica de EM y déficits de la actividad enzimática de los complejos de la CRM, y ausencia de diagnóstico genético, mediante un panel de diseño propio basado en NGS que contenía 133 genes estructurales del sistema OXPHOS y de sus factores de ensamblaje. En 16 pacientes de la cohorte se identificaron 11 variantes patogénicas o probablemente patogénicas, así como, 15 nuevas variantes candidatas, clasificadas como variantes de significado clínico incierto (VUS, del inglés “variant of uncertain significance”), en 12 genes del sistema OXPHOS. Con este estudio se logró una tasa diagnóstica del 10% en esta cohorte, por lo que el resto de los pacientes (90%) mostraron resultados moleculares no concluyentes o no informativos, lo que sugiere que su caracterización genético-molecular requiere el uso de análisis genómicos menos dirigidos. La segunda parte de esta tesis, se ha focalizado en la caracterización de la patogenicidad de las VUS identificadas en 4 genes distintos del complejo I de la CRM (NDUFA13, NDUFS4, ACAD9 y FOXRED1), en fibroblastos primarios de piel de pacientes. Para ello, se propuso la realización de diversos estudios bioquímicos, moleculares y celulares con el fin de evaluar la posible disfunción en el sistema OXPHOS. Entre ellos, tasa de crecimiento celular, actividad enzimática de los complejos de la CRM, respirometría celular, expresión cualitativa y cuantitativa de ARNm, determinación de niveles proteicos específicos OXPHOS, y análisis del ensamblaje e integridad de los distintos complejos y supercomplejos de la CRM. Los resultados indican que las nuevas variantes son la causa subyacente de la deficiencia aislada del complejo I de la CRM, y que, posiblemente, sean las causantes del fenotipo clínico de estos pacientes al combinarse estos hallazgos experimentales con datos clínicos, de segregación familiar y de predictores de patogenicidad in silico. Estos resultados sugieren que la realización de los estudios de genómica funcional OXPHOS en muestras de pacientes son una herramienta eficaz para evaluar la patogenicidad de VUS priorizadas en genes OXPHOS. Este hecho, permite clasificar genéticamente a estos pacientes, proporcionarles un adecuado consejo genético y conocer mejor los mecanismos biológicos de la disfunción mitocondrial. En particular, en esta tesis: a) se caracterizó la segunda familia con variantes patogénicas en el gen NDUFA13, y b) se identificó, en una familia, una variante homocigota en el gen NDUFS4 y la presencia de disomía uniparental, qué es un fenómeno de segregación cromosómica escasamente descrito en el ámbito de las EM y que cambia drásticamente el consejo genético de las familias.