Estudio de la conectividad interhemisférica del cuerpo calloso: papel del receptor Neuropilina-1 y generación de un modelo animal de inactivación condicional para Cux1

Abstract

La neocorteza de los mamíferos es responsable de la integración más elevada de la información sensorial, de las funciones cognitivas superiores, de los comportamientos complejos, y en parte, de la consciencia. Esto es posible gracias a los complejos circuitos que establecen las neuronas que la pueblan. Uno de estos circuitos es el cuerpo calloso (CC) que, conectando ambos hemisferios cerebrales de los mamíferos placentarios, media la integración bilateral necesaria para el desarrollo de funciones de alto orden. La formación y desarrollo del CC es un proceso complejo en el que intervienen muchos y diversos factores moleculares intrínsecos y extrínsecos a la neurona. Uno de los factores implicados en el desarrollo axonal de las proyecciones callosas es el receptor Neuropilina-1 (Nrp1). Estudios anteriores describieron que la señalización vía Nrp1 media el cruce de la línea media y determina la elección de las vías dorsal o ventral para la extensión de los axones a lo largo del CC. Alterando el gradiente de expresión de Nrp1 de las neuronas L2/3 mediante electroporación in utero y, usando marcadores axonales retrógrados, nosotros hemos demostrado que Nrp1 en el área somatosensorial favorece la organización homotópica de las ramificaciones axonales. Por un lado, observamos que el silenciamiento de Nrp1 reduce la estabilización de las proyecciones callosas procedentes del área somatosensorial secundaria (S2) y, por otro, que su sobre-expresión aumenta el número de proyecciones heterotópicas de las neuronas L2/3 localizadas en el área somatosensorial primaria (S1) y disminuye las homotópicas procedentes de S2. El factor de transcripción Cux1 aporta identidad de subclase a neuronas corticales de la L2/3 y L4. Una limitación fundamental para el estudio de las funciones de Cux1 es que su inactivación sistémica en ratón produce un fenotipo letal al nacimiento. Por ello, para investigar los efectos de su pérdida de función de manera precisa, de tipo celular específica, y en distintos momentos del desarrollo, generamos un alelo Cux1 flanqueado por secuencias LoxP, empleando una tecnología novedosa basada en CRISPR-Cas9. Mediante el cruce con una línea transgénica específica de la L4 o la electroporación in utero dirigida a las neuronas de la L2/3, demostramos que la recombinación de este alelo por la enzima CRE produce la perdida de la proteína CUX1 de manera eficiente. Seguidamente iniciamos los estudios funcionales. Si bien, trabajos previos demostraron que el silenciamiento de Cux1 mediante ARN de interferencia provoca un fallo completo en la estabilización de proyecciones L2/3 callosas, el estudio de nuestra línea condicional demuestra que la inactivación del gen Cux1 en la L2/3 no provoca una pérdida de inervación contralateral, sino un aumento de las ramificaciones en las zonas más mediales. En conjunto, nuestros estudios contribuyen a la compresión del desarrollo de los circuitos corticales y las enfermedades del neurodesarrollo. Esperamos que, en un futuro próximo, las herramientas generadas faciliten la adquisición de conocimiento relevante para el campo de la neurobiología del desarrollo