Recombination-independent genomic editing and chromosomal site-focused diversification of Gram-negative bacteria

Abstract

A pesar del creciente interés en la edición de genomas microbianos para investigaciones fundamentales y aplicaciones biotecnológicas, todavía hay una escasez de herramientas genéticas para diseñar eficazmente bacterias Gram negativas no-modelo. En este contexto, el objetivo general de esta Tesis ha sido el aumentar las metodologías para la introducción de diversos tipos de mutaciones en diferentes especies bacterianas y fondos genéticos con múltiples propósitos. Con este fin, hemos adaptado la tecnología targetron basada en el intrón del grupo II de Lactococcus lactis, Ll.LtrB, para ser usada en combinación con CRISPR/Cas9 como forma de contraselección. Los intrones del grupo II son un tipo de retroelementos que pueden insertarse en regiones específicas de moléculas de ADN. Sus dianas pueden modificarse de forma que estos intrones pueden ser alterados para reconocer e insertarse en regiones deseadas del genoma, normalmente, con baja frecuencia. Gracias a la contraselección basada en CRISPR/Cas9, la eficiencia para identificar inserciones de Ll.LtrB en Escherichia coli y Pseudomonas putida se incrementó significativamente. Asimismo, pudimos ilustrar la posibilidad de usar esta combinación para mejorar la eficiencia del transporte de fragmentos insertados dentro de Ll.LtrB hacia el genoma de bacterias Gram negativas. Incluso si el límite de tamaño de los fragmentos a transportar fue moderado, también hemos descrito una aplicación útil del sistema para la integración de secuencias cortas que puedan funcionar como identificadores únicos o códigos de barra genéticos en diferentes organismos biológicos. Ya que una de las principales ventajas de los intrones del grupo II es tener un amplio rango de huéspedes, sostenemos que este uso puede ser de gran importancia en la implementación estándar de códigos de barras genéticos para la identificación de chasis relevantes en biotecnología y la protección de propiedad intelectual. Con esto en mente, hemos conseguido aplicar de forma exitosa esta tecnológica basada en la combinación de Ll.LtrB/CRISPR/Cas9 para marcar la cepa bacteriana P. putida KT2440 y su cepa derivada, P. putida EM383, una Factoría Celular. Por otro lado, hemos caracterizado el funcionamiento de los editores de bases generados por fusiones entre citosina deaminasas y la ARN polimerasa del fago T7 en la cepa P. putida EM42, la versión recA+ de la Factoría Celular. Las citosina deaminasas son enzimas capaces de catalizar la desaminación de citosinas a uracilos, generando así transiciones de citosina a timina o uracilo dependiendo de la molécula diana, ADN o ARN. Hemos demostrado el buen comportamiento de dos editores de bases diferentes en esta cepa y hemos llevado a cabo los experimentos necesarios para reducir los niveles basales de expresión de esta herramienta. Esto es beneficioso para asegurar una baja toxicidad del sistema, así como la estabilidad del genotipo seleccionado después de un proceso de evolución. Finalmente, hemos sentado las bases para el desarrollo de una nueva herramienta genética para la identificación de sitios de interacción en el genoma de proteínas de unión al ADN que puede ser utilizado en ciertos escenarios donde las tecnologías actuales presentan limitaciones. Con este fin, hemos usado una novedosa toxina de origen bacteriano con actividad citosina deaminasa, llamada DddA, la cual es capaz de actuar en ADN de doble cadena, una característica inédita que no había sido previamente observada en otra citosina deaminasa hasta la fecha