Estudio de la regulación de la barrera endotelial por las Rho GTPasas de la subfamilia RhoA

Abstract

Las células endoteliales vasculares forman una barrera semipermeable que recubre la superficie interna del vaso y permite el paso de oxígeno, nutrientes y diferentes moléculas desde el torrente sanguíneo hacia los diferentes tejidos y órganos. La función de barrera es mantenida gracias a las uniones adherentes formadas por VE-cadherina, que están asociadas y estabilizadas por el citoesqueleto de actina. Además, las barreras endoteliales se fortalecen mediante uniones adherentes reticulares, una organización única en los contactos célula- célula donde VE-cadherina interactua con la molécula de adhesión endotelial plaquetaria, PECAM-1, para mantener la integridad de la barrera. Durante la respuesta inflamatoria, la monocapa endotelial aumenta su permeabilidad para permitir la extravasación de células inmunes hacia el foco inflamatorio, y, una vez resuelta la inflamación, se cierra para volver a formar y mantener una barrera semipermeable íntegra. Sin embargo, un aumento de la permeabilidad de manera descontrolada o crónica subyace a la progresión de numerosas enfermedades inflamatorias como la septicemia, la esclerosis múltiple o la COVID-19. Por tanto, el mantenimiento de la función de barrera endotelial y la regulación de su permeabilidad es esencial para mantener la homeostasis del organismo y tiene un extraordinario interés biomédico. Esta tesis se centra en el estudio de la regulación de la función de barrera en condiciones homeostáticas por los tres miembros de la subfamilia RhoA de Rho GTPasas. La subfamilia RhoA, compuesta por RhoA, RhoB y RhoC, es el principal regulador de las fibras de actomiosina que median la contracción celular y apertura de la barrera durante la respuesta inflamatoria. Sin embargo, hemos descubierto mediante la inactivación y activación de RhoA, RhoB y RhoC con la exoenzima C3 transferasa y la proteína quimérica CN03, respectivamente, que esta subfamilia de proteínas también juega un papel en el mantenimiento de las uniones adherentes y la homeostasis de la función de barrera. CN03, que contiene el dominio catalítico del factor necrótico citotóxico bacteriano de Yersinia pseudotuberculosis (CNFY), activa endógenamente RhoA, RhoB y RhoC, refuerza la integridad de la barrera endotelial y las uniones reticulares formadas por VE-cadherina y PECAM-1, y atenúa la rotura de la monocapa celular en respuesta a LPS y sueros de pacientes con septicemia in vitro. La dinámica de VE-cadherina-Dendra2 fotoconvertible sugiere que CN03 estabiliza VE-cadherina preferentemente en las uniones de tipo reticular, asociadas a un fenotipo pro-barrera. Además, CN03 reduce la permeabilidad en respuesta a estímulos inflamatorios locales y disminuye el edema tisular y los niveles plasmáticos de citoquinas in vivo en un modelo murino de inflamación sistémica. Aunque CN03 activa RhoA, RhoB y RhoC, mostramos que su efecto pro-barrera es dependiente de RhoC, incrementando su localización y activación cerca de las uniones intercelulares. En efecto, el silenciamiento de RhoC produce la disolución del anillo de actomiosina periférico, la formación de fibras de estrés y la reducción de VE-cadherina y PECAM-1 en las uniones intercelulares, todo lo cual conlleva el debilitamiento de las uniones y el aumento drástico la permeabilidad paracelular. Por el contrario, la inducción de la expresión de RhoC produce el efecto opuesto y atenúa el aumento de permeabilidad en respuesta a LPS. Esta regulación de la tensión periférica es dependiente de la actividad de la quinasa de la cadena ligera de la miosina, MLCK. Por lo tanto, nuestros datos indican que RhoC está íntimamente relacionada con la conservación de la barrera vascular, y que la activación endógena de las GTPasas de la subfamilia RhoA, particularmente RhoC, en los contactos célula-célula fortalece la estabilidad de las uniones. Este estudio revela un papel terapéutico potencial de la activación de la subfamilia RhoA para prevenir de una permeabilidad excesiva en enfermedades en las que el mantenimiento de la función de barrera endotelial es crucial