Estudio de la α-glucosidasa de la levadura Metschnikowia reukaufii y su empleo en procesos biocatalíticos para la producción de oligosacáridos bioactivos de la miel

Abstract

En este trabajo se detectó una actividad enzimática intracelular en la levadura del néctar Metschnikowia reukaufii capaz de hidrolizar sacarosa y de sintetizar por transglucosilación de este azúcar una mezcla de hetero-glucooligosacáridos (hetero-GlcOS), todos ellos constituyentes de la miel. La mezcla de productos estaba compuesta principalmente por isomelezitosa y trehalulosa, y en menor medida de erlosa, melezitosa, teanderosa y esculosa. La enzima responsable de esta actividad se identificó como una α-glucosidasa de tipo I o maltasa (Mr-αGlu). El gen responsable de esta actividad fue caracterizado y expresado heterólogamente en Escherichia coli, lo que permitió la purificación y caracterización bioquímica de la proteína analizada. Además de la capacidad de Mr-αGlu para producir hetero-GlcOS, la enzima sintetizó también isomaltooligosacáridos (IMOS) como la isomaltosa y la panosa en condiciones saturantes de maltosa. Al analizar la estructura tridimensional de Mr-αGlu mediante modelados por homología se identificaron los elementos típicos de la familia 13 de las glicosil hidrolasas, entre ellos, las 4 regiones conservadas que contienen los residuos esenciales para la actividad catalítica de la enzima, y los subsitios de -1 y +1 de unión a glucosa y fructosa, respectivamte. Se logró cambiar la especificidad de Mr-αGlu hacia sustratos con enlaces α-(16) tras las sustituciones T207V-A208G-G209S. La regioselectivdad de este triple mutante también se vio modificada ya glucosiló en mayor medida las posiciones 6-OH que las 4-OH de sustratos como la sacarosa o maltosa. Se abordaron distintas estrategias de inmovilización de Mr-αGlu con el propósito de aprovechar el potencial de esta enzima en procesos continuos. Tanto la adosorción de Mr-αGlu en perlas de quitosano como el atrapamiento en polivinil alcohol o nanopartículas de sílica biomimética, originó biocatalizadores estables desde el punto de vista operacional y con buenas capacidades biosintéticas para la producción de hetero-GlcOS. De hecho, algunos de los inmovilizados se emplearon con éxito en biorreactores de lecho fijo durante 30 días. La isomelezitosa fue producida empleando biocatalizadores basados en células enteras de E. coli y Pichia pastoris en perlas de alginato cálcico, y después purificada de las mezclas de reacción con un grado de pureza superior al 95%. El efecto prebiótico de este azúcar fue analizado in vitro utilizando bacterias probióticas del género Lactobacillus y Enterococcus, donde además de promover el crecimiento bacteriano, estimuló la producción de ácidos de grasos de cadena corta, principalmente butirato, que se relaciona con la integridad del epitelio gastrointestinal y la prevención del cáncer de colon