Estructura cristalográfica de enzimas reguladoras de inositoles polifosfato

Abstract

Los inositoles polifosfato, pertenecientes a la familia de los inositidos, son moléculas pequeñas derivadas del myo-inositol que las células eucariotas emplean como segundos mensajeros en multitud de funciones, como la liberación del calcio intracelular, el crecimiento, la remodelación vesicular, la apoptosis o la homeostasis del fósforo. Estos compuestos también sirven a su vez de sustrato para la síntesis de otros inositidos y se encuentran desregulados en muchas enfermedades, entre las que destaca el cáncer. Por este motivo, la síntesis y la degradación de los inositoles fosfato se encuentran estrechamente controladas por un grupo de enzimas que incorporan grupos fosfato en las diferentes posiciones del anillo de inositol (quinasas) o los escinden (fosfatasas). En este trabajo, hemos estudiado las bases moleculares que guían el reconocimiento de distintos análogos de inositidos y otros polifosfatos en los centros activos de dos enzimas: una fosfatasa de levadura promiscua, con plegamiento tipo Nudix (ScDDP1), y una quinasa de humano perteneciente a la familia de las inositol polifosfato quinasas (HsIP33K). Ambas proteínas tienen implicaciones muy notables en la función celular debido a la naturaleza de los sustratos que transforman. Así, ScDDP1 es capaz de hidrolizar inositoles pirofosfato, un grupo particular de inositidos esenciales en la regulación de la apoptosis y el metabolismo energético, entre otros procesos. Esta enzima está además muy relacionada con la homeostasis del fosfato intracelular, siendo también capaz de hidrolizar otros sustratos como los polifosfatos. Esta función es especialmente importante en el metabolismo del fosfato en hongos, lo que la convierte en una diana de interés para el tratamiento de infecciones fúngicas. Por otro lado, HsIP33K es capaz de fosforilar el inositido más estudiado por su implicación como segundo mensajero en la señalización del calcio intracelular: el InsP3. En consecuencia, se ha detectado la alteración de esta enzima en diversas patologías, como el cáncer. Para conseguir nuestros objetivos, hemos producido y cristalizado muestras puras de ambas proteínas para, a continuación, obtener sus estructuras tridimensionales en presencia de una gran variedad de ligandos, mediante la técnica de difracción de rayos X. Tras un análisis estructural exhaustivo, hemos complementado la información extraída con otras técnicas de caracterización de enzimas, como mutagénesis dirigida, medidas de la estabilización térmica por fluorescencia o cuantificación de la actividad enzimática. Finalmente, hemos validado un método de docking y predicho la unión de nuevos ligandos de HsIP33K-KD. Todo este trabajo nos ha permitido desentrañar las claves moleculares responsables tanto del reconocimiento multisustrato de ScDDP1, como de los límites de especificidad de HsIP33K-KD, con la finalidad de entender los mecanismos moleculares que subyacen a la regulación de estos inositidos. Este conocimiento es especialmente relevante en el área de la Biomedicina, en el contexto del diseño de inhibidores específicos que puedan ser utilizados como fármacos, así como en la Biotecnología, para el diseño de enzimas “a la carta” que sirvan como herramientas biosintéticas de nuevos inositidos, o en la Biología Celular, para estudios in vivo que puedan elucidar nuevas funciones de estas moléculas pleiotrópicas en las células