Establecimiento de un sistema de diferenciación celular en organoides colónicos humanos. Efecto de la vitamina D

Abstract

El epitelio intestinal es uno de los tejidos de más rápida renovación del organismo, consecuencia de la capacidad de proliferación y diferenciación de las células troncales/stem del fondo de las criptas de Lieberkühn a los distintos linajes celulares. Estudios en modelos genéticos de ratón y líneas humanas inmortalizadas han propuesto la participación en estos procesos de proliferación y diferenciación de varios tipos celulares del microambiente (estroma o nicho) y de las rutas de señalización WNT/β-catenina, Notch, BMP, EGF, Hedgehog e Hippo. En esta Tesis se ha puesto a punto un sistema de diferenciación celular en organoides colónicos humanos generados por las células stem de las criptas de tejido sano de pacientes con cáncer colorrectal (CCR). Los estudios realizados empleando medios de cultivo suplementados con agentes o inhibidores han permitido una completa diferenciación a los linajes celulares mayoritarios del epitelio colónico, enterocítico y mucosecretor, que finalmente conduce a la muerte celular. No se ha observado diferenciación al linaje enteroendocrino ni a células Tuft. Tanto los análisis de la expresión de marcadores genéticos mediante RT-qPCR, Western blot e inmunofluorescencia, como los ensayos transcriptómicos globales (RNA-seq) y los estudios ultraestructurales empleando microscopía electrónica han mostrado la importancia de las rutas BMP y Notch, y de la inactivación de la ruta WNT/β-catenina. El tratamiento combinado con BMP4 y DBZ (inhibidor de la ruta Notch) modifica profundamente el perfil de expresión génica de los organoides, de modo distinto según la edad de los pacientes de los que se generaron. Por el contrario, los organoides colónicos tumorales, que son generados por las células cancerosas stem (Cancer Stem Cells) de los CCR, son muy poco sensibles a los medios utilizados, y solo exhiben una mínima respuesta de diferenciación celular. Se ha estudiado también la acción de la vitamina D sobre estos procesos de diferenciación en organoides normales y tumorales. Su metabolito más activo, el calcitriol o 1α,25-dihidroxivitamina D3, reduce en organoides normales la diferenciación celular favoreciendo el mantenimiento del fenotipo indiferenciado de las células stem, lo que se traduce en una mayor viabilidad de los organoides, principalmente en los generados a partir de pacientes de más edad. Asimismo, tanto el número de genes regulados por calcitriol como las funciones en las que están implicados difieren según la edad. En organoides tumorales, por el contrario, y de acuerdo con su propuesta acción antitumoral, el calcitriol induce parcialmente características fenotípicas de diferenciación celular