Desarrollo de terapias específicas de mutación en enfermedades metabólicas hereditarias

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dc.contributor.advisor Pérez González, Belén (dir.)
dc.contributor.author Yuste Checa, Patricia
dc.contributor.other UAM. Departamento de Biología Molecular es_ES
dc.date.accessioned 2015-06-11T11:17:50Z
dc.date.available 2015-06-11T11:17:50Z
dc.date.issued 2015-03-06
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10486/666705
dc.description Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular. Fecha de lectura: 06-03-2015 es_ES
dc.description.abstract La caracterización funcional específica de mutaciones causantes de enfermedad guía el desarrollo de estrategias terapéuticas. En este trabajo hemos analizado funcionalmente mutaciones que afectan al proceso de splicing y mutaciones missense con el fin de desarrollar terapias específicas dirigidas a rescatar transcritos aberrantes y mutaciones desestabilizadoras. En primer lugar, mediante el análisis del perfil transcripcional de células derivadas de pacientes hemos caracterizado una mutación exónica y otra intrónica interna que afectan ambas al proceso de splicing. La mutación exónica (c.75C>T), detectada en el gen ALDH7A1, genera un nuevo sitio donador de splicing provocando la deleción de 35pb del exón 1 causando epilepsia dependiente de piridoxina (PDE). La mutación intrónica interna (c.792+182G>A), identificada en el gen TMEM165 activa la inserción de un pseudoexón de 117pb procedentes del intrón 4 causando el defecto congénito de glicosilación TMEM165-CDG. El efecto de estas dos mutaciones sobre el proceso de splicing ha sido confirmado mediante el uso de un sistema ex vivo de minigenes. Por otra parte, con el fin de caracterizar funcionalmente mutaciones missense identificadas en pacientes con CDG causado por deficiencia de la enzima PMM2 (PMM2-CDG), hemos estudiado el perfil de oligomerización, la actividad y la estabilidad de estos mutantes en un sistema de expresión procariota. Los resultados in vitro combinados con análisis in silico mediante el algoritmo computacional FoldX y la localización de los residuos en un modelo estructural de la proteína PMM2, nos ha permitido la clasificación de los nueve mutantes estudiados en tres categorías: mutaciones que afectan al plegamiento (p.V44A, p.D65Y, p.R162W, p.T237M, p.F207S y p.C241S), que retienen cierta actividad residual, mutaciones que afectan al plegamiento y a las propiedades catalíticas de la proteína (p.R123Q y p.R141H), las cuales tienen actividad nula, y una mutación que afecta a la dimerización de PMM2 (p.P113L). Además, ha sido posible la recuperación de la actividad de algunos de los mutantes inestables en un modelo celular de enfermedad en condiciones permisivas de plegamiento. Todos estos resultados sugieren que la pérdida de función de la mayoría de los mutantes estudiados está basada en su inestabilidad y por lo tanto en su tendencia a agregar o a ser degradados, mecanismo subyacente en las denominadas enfermedades conformacionales. Basándonos en estos resultados, el siguiente paso ha sido la búsqueda de terapias dirigidas a rescatar los defectos de splicing y los mutantes inestables caracterizados previamente. Respecto a las mutaciones de splicing, hemos conseguido una recuperación del perfil transcripcional y de la proteína correctamente localizada de manera secuencia y dosis específica, tras el tratamiento con oligonucleótidos antisentido que modulan el splicing de células de pacientes PDE y TMEM165- CDG portadoras de las mutaciones c.75C>T y c.792+182G>A respectivamente. El éxito de la terapia antisentido aplicada sobre una mutación exónica, constituye una prueba de concepto que amplía su posible uso más allá de mutaciones intrónicas internas. Respecto a la terapia de recuperación de mutantes inestables, el rastreo de una librería comercial de compuestos nos ha permitido identificar quince potenciales chaperonas farmacológicas (PCs) que estabilizan la proteína PMM2. Estos compuestos han sido evaluados posteriormente en un sistema de expresión procariota y algunos de ellos han sido capaces de aumentar significativamente la actividad de la proteína WT y la estabilidad, tanto de la PMM2 WT como de los mutantes de plegamiento. Además, cuatro compuestos han conseguido rescatar la actividad de dos mutantes inestables, p.R162W y p.T237M, en un modelo celular de enfermedad. Al mismo tiempo, hemos identificado un regulador de la proteostasis (PR), celastrol, que también ha sido capaz de incrementar la actividad de mutantes inestables de PMM2 en el mismo modelo celular. Así, el celastrol podría ser aplicado conjuntamente con PCs con el fin de aumentar de manera sinérgica la estabilidad de los mutantes y por tanto su actividad. Estos resultados constituyen una prueba de concepto sobre el posible uso de fármacos estabilizadores que recuperen la actividad de PMM2 y establece las bases para el desarrollo de una nueva terapia para PMM2-CDG, el CDG más común y actualmente sin tratamiento. En resumen, el éxito de las aproximaciones terapéuticas descrito en este trabajo para PDE, TMEM165-CDG y PMM2-CDG, abre nuevas perspectivas para el tratamiento de enfermedades raras al demostrar la eficacia de terapias basadas en el mecanismo de acción de las mutaciones. es_ES
dc.description.abstract Functional characterization of disease causing mutations guides the development of tailored therapeutic strategies. In this work we have analyzed functionally mutations affecting the splicing process and also missense mutations to address the development of mutation specific therapies aimed to rescue aberrant mRNA transcripts or unstable mutant proteins. Firstly, we have characterized one exonic and one deep intronic mutation, both affecting the splicing process, by analyzing the transcriptional profile of patients-derived cells. The exonic mutation (c.75C>T), detected in ALDH7A1, generates a new exonic donor splice site generating an aberrant transcript bearing a deletion of 35 nucleotides causing piridoxine-dependent epilepsy (PDE). The deep intronic mutation (c.792+182G>A), identified in TMEM165 activates an intronic pseudoexon insertion of 117 nucleotides causing a congenital disorder of glycosylation (TMEM165- CDG). The effect of these two mutations on the splicing process has also been confirmed using an ex vivo minigene system. Secondly, in order to characterize functionally missense mutations identified in CDG due to PMM2 deficiency (PMM2-CDG), we have studied mutants´ oligomerization profile, PMM2 activity and stability in a prokaryotic expression system. The in vitro results combined with the in silico analysis by the FoldX algorithm and the residue location in a PMM2 protein structure model allowed us to classify the nine studied mutants into three categories: destabilizing mutations (p.V44A, p.D65Y, p.R162W, p.T237M, p.F207S and p.C241S) which retain some residual activity, mutations affecting both folding and catalytic properties of the protein (p.R123Q and p.R141H) which retain null residual activity, and one mutation affecting PMM2 dimerization (p.P113L). Additionally, we have rescued PMM2 residual activity in a disease cellular model using permissive folding conditions. These results suggest that the loss-of-function of most of these mutant proteins is based on increased susceptibility to degradation and/or aggregation, a common mechanism underlying conformational diseases. Based on these results we have sought specific therapies to rescue splicing defects and unstable mutant proteins. Regarding the splicing mutations, we have been able to recover in dose and sequence specific manner the correct transcriptional profile and the proper proteins´ location by applying splice-switching oligonucleotides to PDE and TMEM165-CDG patient derived cells carrying c.75C>T and c.792+182G>A mutations respectively. The success of the exonic mutation therapy is a proof-of-concept which broadens the application of antisense therapy beyond deep intronic mutations. With respect to the therapy to recover the activity of unstable mutant proteins, a highthroughput screening of a commercial compounds library has allowed us to find fifteen potential pharmacological chaperones (PCs) for PMM2. These hits have been subsequently evaluated in a prokaryotic system and some of them have increased significantly WT PMM2 activity and also WT and mutants´ stability. Furthermore, four of them have rescued PMM2 activity in a cellular disease model carrying either the destabilizing mutation p.R162W or p.T237M. In addition, we have identified a proteostasis regulator (PR), celastrol, which has also increased mutants´ activity in the same eukaryotic system. The PR could be co-applied with PCs in order to increase mutants´ stability and subsequently residual activity in a synergistic manner. These results are a proof-of-concept of the PMM2-CDG treatment by small stabilizer molecules and pave the way to develop a new promising therapy for PMM2-CDG, the most common CDG for which, up to date, there is no curative treatment available. In conclusion, the success of the therapeutic approaches on PDE, TMEM165-CDG and PMM2- CDG described in this work shed some light on novel treatments for other rare diseases by specific mutation therapies aimed at mRNA or protein targets. en_US
dc.format.extent 159 pag. es_ES
dc.format.mimetype application/pdf en
dc.language.iso spa en
dc.language.iso eng en
dc.subject.other Enefermedades hereditarias metabólicdas - Tesis doctorales es_ES
dc.title Desarrollo de terapias específicas de mutación en enfermedades metabólicas hereditarias es_ES
dc.type doctoralThesis en
dc.subject.eciencia Biología y Biomedicina / Biología es_ES
dc.rights.cc Reconocimiento – NoComercial – SinObraDerivada es_ES
dc.rights.accessRights openAccess en


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