Searching for regulators of the mammalian dNTP pool

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dc.contributor.advisor Fernández-Capetillo, Óscar (dir.)
dc.contributor.author Specks, Julia
dc.contributor.other UAM. Departamento de Biología Molecular es_ES
dc.contributor.other Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO) es_ES
dc.date.accessioned 2016-03-18T10:58:48Z
dc.date.available 2016-03-18T10:58:48Z
dc.date.issued 2015-10-23
dc.identifier.uri http://hdl.handle.net/10486/670397
dc.description Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid, Facultad de Ciencias, Departamento de Biología Molecular: Fecha de lectura: 23-10-2015 es_ES
dc.description.abstract DNA replication is a tightly controlled process with its misregulation leading to a type of DNA damage, known as replication stress (RS). RS is essentially defined as an accumulation of unprotected single-stranded DNA (ssDNA) at stalled replication forks (RF). Due to the recombinogenic nature of ssDNA, it is a cause of genomic rearrangements frequently observed in cancer. One way by which ssDNA can arise is an insufficient supply of nucleotides (dNTPs), which limits the progression of the DNA polymerases. Accordingly, reduced dNTP levels have been proposed as a source of genomic instability in cancer. In order to protect their genomes, cells need to detect and limit the amount of ssDNA. ATR is the initial kinase that responds to RS in mammals, resulting in a phosphorylation cascade that finally leads to cell cycle arrest and safeguarding of replication fork integrity. While it remains unclear how exactly ATR suppresses RS, evidences from yeast suggest that ATR might reduce RS through stimulating the production of nucleotides. In Saccharomyces cerevisiae (S.cerevisiae), lethality of the ATR ortholog Mec1 can be rescued by concomitant deletion of Suppressor of Mec1 lethality1 (Sml1), an inhibitor of the ribonucleotide reductase (RNR). In all eukaryotes, RNR catalyzes a rate limiting step in dNTP synthesis by reducing NDPs to dNDPs in a tightly controlled process. The RNR is a heterotetrameric complex composed of a catalytic subunit (Rnr1 and RRM1 in yeast and mouse respectively) and a regulatory subunit (Rnr2 and RRM2 in yeast and mosue respectively) whose structure and function are well conserved throughout evolution. Although the sequence where Sml1 binds to Rnr1 is conserved in mammals and yeast Sml1 binds and inhibits the mammalian RNR, it remains unclear whether ATR-dependent regulation of RNR is conserved beyond yeast. In this work we investigated the putative relationship between RS, ATR and RNR activity, and searched for mammalian regulators of the RNR. Although we failed to identify new regulators of the RNR, we could establish that increased RNR activity alleviates phenotypes associated with ATR-deficiency in mice in vitro and in vivo, pointing towards a functional conservation of the ATR-dependent regulation of the dNTP-pool in mammals. In addition, we show that a point mutation within a single conserved residue in RRM1 prevents binding to RRM2 causing early embryonic lethality in mice. Despite the impact of the mutation, Rrm1+/WG mice present no obvious phenotype suggesting that RRM1 exists in excess in mammalian cells. This data reveals that binding of RRM1 to RRM2 is essential for viability, and provides the first loss-of-function model of the RNR complex for genetic studies in mammals en_US
dc.description.abstract La replicación del ADN es un proceso que ha de ser controlado con precisión. Su desregulación genera un tipo de daño en el ADN conocido como estrés replicativo (ER). El ER se define como la acumulación de ADN de cadena sencilla (ssDNA) desprotegido en las horquillas de replicación (RF) que se han bloqueado. Debido a su naturaleza recombinogénica, el ssDNA puede causar reordenamientos genómicos, algunos de los cuales ocurren frecuentemente en cáncer. Una de las razones por las que se acumula ssDNA es un aporte insuficiente de nucleótidos (dNTPs) que limita la progresión de las ADN-polimerasas. De este modo, se ha propuesto que los niveles reducidos de dNTPs son una fuente de inestabilidad genómica en cáncer. Con objeto de proteger sus genomas, las células necesitan detectar y limitar la cantidad de ssDNA. ATR es la principal quinasa que responde a ER en mamíferos, lo que resulta en la activación de una cascada de fosforilaciones que limita el avance en el ciclo celular al tiempo que mantiene la integridad de las horquillas de replicación. Si bien no se conoce el mecanismo exacto por el que la activación de ATR suprime ER, los resultados obtenidos en levadura sugieren que ATR podría estimular la producción de nucleótidos y así limitar el ER. En Saccharomyces cerevisiae, la mutación del ortólogo de ATR, Mec1, es letal y este fenotipo puede ser rescatado mediante la deleción simultánea de un inhibidor de la enzima ribonucleótido reductasa (RNR), Suppressor of Mec1 lethality 1 (Sml1). En todos los organismos eucariotas la RNR cataliza un paso limitante en la síntesis de dNTPs, reduciendo NDPs a dNDPs en un proceso que está altamente regulado. La RNR es un complejo heterotetramérico compuesto por una subunidad catalítica (Rnr1 o RRM1; en levadura o ratón, respectivamente) y una subunidad reguladora (Rnr2 o RRM2; en levadura o ratón, respectivamente), cuya estructura y función están muy conservadas a lo largo de la evolución. A pesar de que la secuencia que Sml1 reconoce en Rnr1 está conservada desde levaduras a mamíferos, y a pesar de que Sml1 de levadura une e inhibe a la RNR de mamíferos in vitro, se desconoce si la regulación de la RNR por parte de ATR se conserva más allá de levaduras. En este trabajo hemos investigado la posible relación entre ER, ATR y la actividad RNR, y hemos buscado nuevos reguladores de la RNR en mamíferos. Si bien no hemos conseguido identificar nuevos reguladores de la RNR, hemos establecido que un incremento de la actividad RNR alivia los fenotipos ocasionados por una deficiencia en ATR in vitro e in vivo, lo que indica que la regulación de los reservorios de dNTPs por parte de ATR está conservada en mamíferos. Además, hemos mostrado que la mutación de un sólo residuo conservado de RRM1 evita la interacción de esta proteína con RRM2, y causa letalidad embrionaria temprana en ratones. A pesar del impacto de esta mutación, los ratones Rrm1+/WG no presentan un fenotipo obvio, lo que sugiere que RRM1 está presente en exceso en células de mamífero. Estos datos revelan que la interacción entre RRM1 y RRM2 es esencial para la viabilidad celular, y proveen el primer modelo genético de pérdida de función de la RNR en mamíferos es_ES
dc.description.sponsorship This work has been funded by the Spanish Ministry of Economics and Competitiveness (FPI scholarship) en_US
dc.format.extent 133 pag. es_ES
dc.format.mimetype application/pdf es_ES
dc.language.iso spa en
dc.language.iso eng en
dc.subject.other ADN - Aspectos genéticos - Tesis doctorales es_ES
dc.subject.other ADN - Reparación - Tesis doctorales es_ES
dc.title Searching for regulators of the mammalian dNTP pool en_US
dc.type doctoralThesis en
dc.subject.eciencia Biología y Biomedicina / Biología es_ES
dc.rights.cc Reconocimiento – NoComercial – SinObraDerivada es_ES
dc.rights.accessRights openAccess en


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