Genome-wide binding patterns an chromatin modifications induced by AML1-ETO and MLL-AF9 fusion proteins in Acute Myeloid Leukemia
Author
Maiques Díaz, AlbaEntity
UAM. Departamento de Bioquímica; Centro Nacional de Investigaciones Oncológicas (CNIO)Date
2014-03-27Subjects
Biología molecular - Tesis doctorales; Citogenética - Tesis doctorales; MedicinaNote
Tesis doctoral inédita leída en la Universidad Autónoma de Madrid. Facultad de Medicina. Departamento de Bioquímica. Fecha de lectura: 27 de marzo, 2014Esta obra está bajo una licencia de Creative Commons Reconocimiento-NoComercial-SinObraDerivada 4.0 Internacional.
Abstract
Más del 50% de las leucemias agudas mieloides (LAM) presentan al diagnóstico alteraciones cromosómicas recurrentes. La mayoría producen translocaciones equilibradas que generan proteínas de fusión, las cuales alteran el perfil transcripcional estableciendo el ambiente que permite la transformación leucémica. Entre las translocaciones más frecuentes están la t(8;21)(q22;q22) y la t(9;11)(p22;q23), que producen respectivamente las proteínas de fusión AML1-ETO y MLL-AF9. Mediante estudios de ChIP-chip en progenitores hematopoyéticos que expresan la oncoproteína AML1-ETO hemos identificado nuevos genes diana asociados con modificaciones de la cromatina. La desacetilación de la histona H4 y el aumento de H3K9me3 en los genes diana de AML1-ETO identificados afectan a genes involucrados en vías de señalización esenciales en la diferenciación y auto-renovación de los progenitores hematopoyéticos. La represión inducida por estas marcas de la cromatina se mantiene en muestras primarias t(8;21), y está directa y reversiblemente inducida por la presencia de AML1-ETO. Además, encontramos que más del 50% de los genes diana de AML1-ETO presentan un motivo de unión de Sp1 e identificamos que la proteína Sp1 es crítica para las LAMs dirigidas por AML1-ETO. Estos resultados nos permiten proponer el estudio de terapias dirigidas contra Sp1 en este subtipo leucémico. Por otro lado, observamos que bajas concentraciones del inhibidor de HDACs panobinostat (LBH589) produce toxicidad celular y cambios rápidos en la expresión génica de células leucémicas que expresan la proteína de fusión MLL-AF9. Estudios de ChIP-seq demostraron una hiperacetylacion de histonas consistente con el perfil transcripcional de estas células. Además, más del 50% de los genes diana de MLL-AF9 identificados, presentan H4ac coincidente con la metilación de H3K4 y H3K79 asociada a MLL-AF9. En este contexto, el tratamiento con panobinostat aumenta la presencia de H4ac e induce la activación de genes indirectamente silenciados por MLL-AF9. Sin embargo, mediante arrays de expresión identificamos un aumento de la transcripción de dianas de MLL-AF9, como HOXA9 y MEIS1. Estos resultados dan nuevas pistas sobre el papel de las HDACs en el desarrollo de las LAMs y revelan la sobre-expresión de genes diana de MLL-AF9 como un nuevo mecanismo de acción del panobinostat. Cytogenetic aberrations can be detected in over 50% of newly diagnosed acute myeloid (AML) patients. The majority gives rise to nonrandom chromosomal translocations that often result in fusion proteins, which alter the gene expression profile laying the groundwork for leukemic transformation. Among the most frequently found in AML patients are the t(8;21)(q22;q22) and the t(9;11)(p22;q23), which generates the AML1-ETO and the MLL-AF9 fusion proteins respectively.
By ChIP-chip analysis of human hematopoietic stem/progenitor cells transduced with the AML1-ETO fusion gene we identify new chromatin-modified AML1-ETO target genes. We observed that the presence of either AML1-ETO/HDAC1 complex or increased H3K9me3, on the promoters of AML1-ETO targets, was involved in the repression of hematopoietic differentiation genes and important AML signaling pathways. This silencing is maintained during AML development, as it was also observed on a set of t(8;21) primary samples, and was directly and reversibly induced by AML1-ETO presence. Interestingly, we found a Sp1 binding site in over 50% of AML1-ETO targets and identified that Sp1 protein is critical in myeloid leukemia driven by AML1-ETO, suggesting a role for Sp1 targeted therapy in this leukemia subtype.
Secondly, we investigated the response of AML cells to the pan-HDACi panobinostat (LBH589) and found that low concentrations of panobinostat lead to MLL-AF9 cell toxicity and rapid changes in gene expression. ChIP-seq analysis revealed massive hyperacetylation of histones that was consistent with the transcriptional profile in the presence of MLL-AF9 fusion protein. Furthermore, in over 50% of the identified target genes, H4ac was present along with the known MLL-AF9-induced H3K4me3 and H3K79me2 chromatin marks. In this context, treatment with panobinostat further increases acetylation in H4ac, thus inducing a transcriptional activation of indirectly silenced MLL-AF9 genes. However, by gene expression arrays we also observed increased transcription of active MLL-AF9 target genes such as HOXA9 and MEIS1. Thus, our results provide new insights into the role of HDACs in the leukemogenic process and reveal boosted up-regulation of MLL-AF9 direct targets to be a novel mechanism of action of panobinostat in MLL-rearranged leukemia.
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Table S1, related to Figure 1. AML1- ETO target genes identified by ChIP-chip on the Agilent Human proximal promoter 244K~1
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Table S3, related to Figure 1. Genes found to be AML1-ETO and HDAC1 co-occupied and to present H4 deacetylation on HSPC-AE
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Table S5, related to Figure 1. Genes with simultaneous presence of H3K9me3 and AML1-ETO occupancy
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Table S7, related to Figure 4. Unsupervised sequence analysis of AML1-ETO data by PSCAN algorithm against the JASPAR data~1
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Table S8, related to Figure 4. Unsupervised sequence analysis of AML1-ETO data by PSCAN algorithm against the TRANSFACT d~1
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Table S9, related to Figure 11. Differential expressed genes (DEG) on HSPC-MA9 cells upon LBH589 treatment for 6 and 24 h
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Table S10, related to Figure 11 and 15. Gene sets used for GSEA analysis
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Table S11, related to Figure 13. Hyper-acetylated regions on HSP-MA9 cells (5kb around TSS)
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Table S12, related to Figure 13. Hypo-acetylated regions on HSP-MA9 cells (5kb around TSS)
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Table S13, related to Figure 13. Gene lists of the hyper-acetylated genes significant associated with signaling pathways ~1
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Table S14, related to Figure 14 and 17. MLL-AF9 target genes and associated chromatin marks
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