Characterization of human adenovirus assembly: Structural studies in the cell and in purified incomplete viral particles

Abstract

Los Adenovirus (AdV) se encuentran entre los más complejos de los virus icosaédricos carentes de membrana. Incluso después de resolverse su estructura a resolución cuasi-atómica tanto por crio-microscopía electrónica (crio-ME) como por cristalografía de rayos X, la localización de las proteínas minoritarias de la cápside es aún objeto de controversia. La compleja arquitectura de la cápside es producto de un complicado proceso de ensamblaje, del cual muchos aspectos no han sido clarificados. En particular, no se sabe si los procesos de encapsidación del genoma y ensamblaje ocurren de forma secuencial o concertada. Dos estrategias para estudiar el mecanismo de ensamblaje son: el estudio de partículas de baja densidad purificadas (consideradas intermediarios de ensamblaje), y el seguimiento de las proteínas estructurales y el genoma viral hasta su ensamblaje en células infectadas. En la primera parte de esta tesis, se analizan células infectadas con AdV tipo 5 (Ad5) wild type (wt) a diferentes tiempos de infección y se comparan con un mutante de Ad5 (Ad5/FC31), con un retraso en el proceso de encapsidación. Se realizaron ensayos de inmuno-fluorescencia e inmuno-microscopía electrónica para determinar la localización del ADN viral y las proteínas de encapsidación, core y cápside en células infectadas. Los resultados indican que todos los factores de ensamblaje se localizan en un área previamente descrita como la zona periférica de replicación, la cual sería la factoría de ensamblaje de AdV. Los intermediarios de ensamblaje observados en esta área apoyan el modelo de ensamblaje y encapsidación concertados. El ensamblaje podría dividirse en dos rutas: una sólo para proteínas de la cápside, y otra sólo para el ADN viral y proteínas del core. Solamente cuando ambas rutas están acopladas por la interacción correcta entre proteínas encapsidadoras y componentes del core, se producen las partículas virales completas. La mutación Ad5/FC31 desacopla estas rutas generando cápsides vacías y cuerpos moteados, que son acumulaciones de cores. En la segunda parte de la tesis, la caracterización molecular y estructural de las partículas ligeras de Ad5/FC31 reveló que estas partículas carecen de genoma viral y proteínas del core, pero habían iniciado la encapsidación y maduración sugiriendo que son productos abortivos de ensamblaje. La estructura de estas partículas ligeras analizadas por crio-ME muestra por primera vez la localización de la proteína L1 52/55 kDa dentro de la cápside, y cómo ésta cambia durante la maduración. Finalmente, estas estructuras ayudan a resolver la controversia actual acerca de la localización de las proteínas minoritarias de la cápside

Adenovirus (AdV) is one of the most complex icosahedral, nonenveloped viruses. Even after its structure was solved at near atomic resolution by both cryo-electron microscopy (cryo-EM) and X-ray crystallography, the localization of minor coat proteins is still a subject of debate. The elaborated capsid architecture is the product of a correspondingly complex assembly process, of which many aspects remain unclear. In particular, it is still not settled if assembly and packaging occur in a sequential or concerted manner. Two strategies to investigate the assembly mechanism are: studying purified light viral particles, which are considered assembly intermediates, and following the structural proteins and viral genome fate until their assembly in infected cells. In the first part of this thesis, cells infected with AdV type 5 (Ad5) wild type (wt) were studied at different post-infection times and compared with an Ad5 mutant (Ad5/FC31), which has a delay in the packaging process. Immunofluorescence and immunoelectron microscopy assays were carried out to determine the localization of viral DNA, packaging, core and capsid proteins in infected cells. The results indicate that all assembly factors can be found in an area previously recognized as the peripheral replicative zone, which could therefore be the AdV assembly factory. Assembly intermediates observed in this region support the concerted assembly and packaging model. The assembly process could be divided in two pathways, one for only capsid proteins and another one for viral DNA and core proteins. Only when both pathways are coupled by correct interaction between packaging proteins and genome, the viral particle is produced. The mutation in Ad5/FC31 decouples these pathways generating empty capsids and speckled bodies, which are accumulations of unpackaged cores. In the second part of this thesis, the molecular and structural characterization of Ad5/FC31 light particles revealed that these particles lack genome and core proteins, but had started packaging and maturation, suggesting that they are assembly dead ends. The cryo-EM structures of the Ad5/FC31 light particles provide the first glimpse on the organization of packaging protein L1 52/55 kDa inside the capsid shell, and how this organization changes during maturation. Finally, the cryo-EM structure also helps to settle the controversy regarding localization of the minor coat proteins